LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Líffræðileg virkni

In vitro

Breyting villtra tegundar og G2019S leiðir til 2,5 falt hærra TR-FRET merki sem hægt er að hindra meðLRRK2-IN-1á skammtaháðan hátt með IC50 gildi 0,08 µM og 0,03 µM, hvort um sig [1]. LRRK2-IN-1 hafði IC50 um 45 nM til hömlunar á DCLK2 og sýnir IC50 sem er meiri en 1|im þegar hann var metinn í lífefnafræðilegum prófunum fyrir AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 og PLK1. LRRK2-IN-1 er staðfest að hamla MAPK7 með EC50 upp á 160 nM. LRRK2-IN-1 örvar skammtaháð hömlun á Ser910 og Ser935 fosfórýleringu ásamt tapi á 14-3-3 bindingu við bæði villtar tegundir LRRK2 og LRRK2 [G2019S] stöðugt umbreytta í HEK293 frumur [2]. LRRK2-IN-1 er í meðallagi frumueyðandi og IC50 49,3 µM í HepG2 frumum. LRRK2-IN-1 sýnir eiturverkanir á erfðaefni í viðurvist og fjarveru S9 við 15,6 og 3,9 µM, í sömu röð [3]. LRRK2-IN-1 hindrar útbreiðslu, flæði og örvar frumudauða með einkennum apoptosis á HCT116 og AsPC-1 frumum [4].

In Vivo

LRRK2-IN-1 (100 mg / kg, ip) framkallar fosfórýleringu LRRK2 í nýrum músanna [2]. Útfelld innspýting LRRK2-IN-1 (100 mg / kg) hefur í för með sér verulega lækkun á magni æxlis og þyngd AsPC-1 æxli xenografts [4].

Kinase próf

Virkur GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) og GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527 ) ensím er hreinsað með glútaþíon sefarósa úr HEK293 frumulýsati 36 klst. eftir tímabundna transfection viðeigandi cDNA smíða. Peptíð kínasa prófanir, gerðar í tvíriti, eru settar upp í heildarrúmmálinu 40 mL sem inniheldur 0,5 pg LRRK2 kínasa (sem við u.þ.b. 10% hreinleika gefur lokastyrk 8 nM) í 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20|im Nictide, 0,1|imM [γ-32P] ATP (500 cpm / pmol) og ráðlagður styrkur hemilsins leystur upp í DMSO. Eftir ræktun í 15 mínútur við 30 ° C er hvarfum slitið með því að koma auga á 35 mL af hvarfblöndunni á P81 fosfósellulóspappír og sökkva í 50 mM fosfórsýru. Sýnin eru þvegin mikið og innlimun [γ-32P] ATP í Nictide er magngreind með Cerenkov talningu. IC50 gildi eru reiknuð með GraphPad Prisma með því að nota ólínulega aðhvarfsgreiningu.

Frumurannsókn

Frumur (104 frumur á hverja holu) eru sáð í 96-holna vefjamenningarplötu í þríriti. Frumurnar eru ræktaðar í viðurvist LRRK2-IN-1 með DMSO sem burðarefni við 0, 0,31, 0,63, 1, 2 og 5, 10 og 20 μM. 48 klst. Eftir meðhöndlun er 10 míkróg af TACS MTT-hvarfefni bætt við hverja holu og frumurnar voru ræktaðar við 37 ° C þar til dökkt, kristalt botnfall verður sýnilegt í frumunum. 100 mL af 266 mM NH4OH í DMSO er síðan bætt við borholurnar og sett á hristara á lágum hraða í 1 mínútu. Eftir að hafa verið hrist er plötunni leyft að ræktað í 10 mínútur varið gegn ljósi og OD550 fyrir hverja holu er lesin með því að nota örplötulestur. Niðurstöðurnar eru að meðaltali og reiknaðar sem hlutfall af DMSO (ökutæki) stjórnun + / - staðalskekkja meðaltalsins.

Dýraumsjón

LRRK2-IN-1er leyst upp í Captisol og gefið með inndælingu í kviðarhol í C57BL / 6 músum af villtum gerð í 100 mg / kg skammti. Stýrimúsum er sprautað með jafn miklu magni af Captisol. Á 1 og 2 tíma tímapunkti eru músar útþvottar með því að losa leghálsinn og nýrna- og heilavef sundrast hratt og smella frosinn í fljótandi köfnunarefni.

Tilvísanir

[1]. Hermanson SB, o.fl. Skimun fyrir nýjunga LRRK2 hemla sem nota há-afkastagetu TR-FRET frumugreining fyrir LRRK2 Ser935 fosfórýleringu.PLoS One. 2012; 7 (8): e43580. Epub 2012 28. ágú.

[2]. Deng, Xianming., O.fl. Einkenni sérhæfðs hemils Parkinson' s sjúkdóms kínasa LRRK2. Nature Chemical Biology (2011), 7 (4), 203-205.

[3]. Koshibu K, o.fl. Í staðinn fyrir LRRK2-IN-1 í lyfjafræðilegum rannsóknum á Parkinson' s sjúkdómi. Lyfjafræði. 2015; 96 (5-6): 240-7.

[4]. Weygant N, o.fl. Lítill sameind kínasahemill LRRK2-IN-1 sýnir öfluga virkni gegn krabbameini í endaþarmi og brisi með hömlun á doublecortin-líkum kínasa 1. Molakrabbamein. 2014 6. maí; 13: 103